一、原核注射實驗技術定義與核心原理
原核注射是將外源DNA直接注入受精卵的雄性原核（體積較大且易定位），使外源基因隨機整合至宿主基因組的技術。其核心機制包括：
隨機整合：外源DNA通過非同源末端連接（NHEJ）插入染色體，整合位點與拷貝數不可控。
原核優勢：雄性原核（由精子形成）比雌性原核更易定位，且DNA修復活性高。
瞬時表達窗口：受精卵處于單細胞期，DNA修復系統活躍，利于外源片段整合。
生物學基礎：
受精后12-24小時為操作窗口（小鼠），此時原核清晰可見。
二、原核注射實驗標準化操作流程
（一）前期準備
| 步驟 | 關鍵操作與參數 |
|---|---|
| 載體構建 | 線性化載體（避免質粒骨架整合） + 必需元件（啟動子、編碼區、polyA） |
| 受精卵獲取 | 超排卵處理雌鼠（PMSG/hCG）→ 與雄鼠合籠→ 取見栓后0.5天的受精卵 |
| 顯微注射系統校準 | 注射針內徑1-2μm，壓力5-10 hPa，單次注射體積2pL（含1-2ng DNA） |
（二）注射與胚胎移植
存活率控制：注射后受精卵存活率需＞80%。
移植時機：發育至2細胞期再移植，可提高著床率。
（三）首建鼠（Founder）鑒定
基因型檢測：
PCR法：提取鼠尾DNA，擴增外源基因。
Southern Blot：驗證拷貝數與整合完整性。
表達驗證：
Western Blot（蛋白水平）或RT-PCR（轉錄水平）。
首建鼠特性：
每只Founder為獨立品系（因隨機整合位點不同），需分別建系。
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